Die vollkommen neu überarbeitete Ausstellung in der ehemaligen Klosterkirche am Kornmarkt soll an die theologischen Mitstreiter Martin Luthers erinnern, die von der reinen lutherischen Lehre abwichen oder eigene reformatorische Ideen verfolgten und bisher weitestgehend im Schatten des großen Reformators standen, wie Jakob Strauß, Fritz Erbe oder Andreas Bodenstein von Karlstadt. Die deutschlandweit umfassendste Exposition zu diesem Thema informiert außerdem über Verlauf, Höhepunkte und Nachwirkungen des Deutschen Bauernkrieges im Kontext der Zeit und seine Rezeptionsgeschichte.

Die Popperöder Quelle entstand wohl 1199 durch einen Erdfall. Sie trieb mehrere Mühlen und versorgte die Altstadt mit Wasser. Dankbar ziehen die Mühlhäuser bis heute am Brunnenfest zur Quelle. Im Jahr 1614 ließ Bürgermeister Fleischhauer das Brunnenhaus mit massivem Untergeschoss und einem Fachwerkobergeschoss mit Ecktürmchen und Zwerchgiebel errichten. Die Quelle selbst wurde im Halbrund wie ein Amphitheater mit dem Brunnenhaus als Bühne eingefasst. Entstanden ist so eine der schönsten Quellen Thüringens.

Die Kirche am Mühlhäuser Untermarkt gehört zu den frühesten gotischen Kirchen Mitteldeutschlands- erbaut zwischen 1270 und 1290. Zur wertvollen Ausstattung gehören Glasmalereien des späten 13. Jahrhunderts, die Fensterrosette des Nordquerhauses und der spätgotische Schnitzaltar.

Mühlhausen gehört zu den wenigen Städten, die noch über einen nahezu vollständigen mittelalterlichen Stadtmauerring verfügen. Von den ursprünglich 2,8 km Länge haben sich 2,2 km und eines von vier Haupttoren – das Innere Frauentor – erhalten. Von der Stadtseite dieses Tores aus können die museal gestalteten Befestigungsanlagen über eine Länge von 370 Metern besichtigt werden.

Das Haupthaus der Mühlhäuser Museen stellt in drei Ausstellungsbereichen die Kulturgeschichte der Stadt und Region vor: "UNSTRUTH-HAINICH tiefgründig" zeigt die ur- und frühgeschichtliche Besiedlung des Unstrut-Hainich-Kreises, die jüngere Kunstgeschichte Thüringens präsentiert das "KunstLAND Thüringen".

Das seit 1975 als Museum genutzte Architektur- und Geschichtsdenkmal St. Marien beherbergt seit November 2018 eine Schau zu mittelalterlicher Kunst aus Thüringen. Durch die Anordnung wertvoller Objekte wird der Eindruck eines reich ausgestatteten mittelalterlichen Kirchenraumes wieder erlebbar. Ein weiterer Bereich beschäftigt sich mit Leben und Werk des Predigers und Reformators Thomas Müntzer, der 1524/25 seine Ideen in der Freien Reichsstadt Mühlhausen verkündete, sowie mit dem Fortleben Müntzers in der Erinnerungskultur vor allem der DDR. Daneben informiert die Dauerausstellung über die Baugeschichte der Kirche mit dem höchsten Turm Thüringens sowie über historische Steinmetzkunst.

Die Allerheiligenkirche wurde nach grundlegender Restaurierung 1989 zur Nutzung als Museumsgalerie an die Mühlhäuser Museen übergeben. Aufgrund ihrer reichen kulturhistorischen Ausstattung erhielt sie einen Ausstellungsbereich zur Bau- und Restaurierungsgeschichte und zur barocken Innengestaltung. 

Der Kernbau entstand um 1300. Erweiterungsbauten aus Gotik, Renaissance und Barock ließen ein einzigartiges Bauensemble inmitten der Altstadt entstehen. Besonders sehenswert sind die Halle, die Große Ratsstube mit gotischer Malerei und das Reichsstädtische Archiv (1614).

Viele Kirchtürme prägen die Ansicht der Stadt Mühlhausen und ihr Stadtzentrum. Die Pfarrkirche St. Josef befindet sich im östlichen Stadtteil Mühlhausens und liegt inmitten eines Wohngebietes. Die Kirche ist vom Zentrum aus sehr gut zu Fuß erreichbar und auch der Bahnhof der Stadt ist nur wenige Gehminuten entfernt.

Seit dem April 2004 befindet sich die Stadtbibliothek Mühlhausen in der sanierten und umgebauten Jakobikirche. Hier wurden Hauptbibliothek und Kinderbibliothek I Phonothek unter einem Dach zusammengebracht. Als Kultur- und Bildungseinrichtung bildet die Arbeit mit Kindern, insbesondere die Leseförderung einen Schwerpunkt der Tätigkeiten des Bibliothekteams. Die Jakobikirche ist zudem ein beliebter Veranstaltungsort für Vorträge, Autorenlesungen und Konzerte.